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| 细胞凋亡与骨代谢紊乱疾病 |
一、概述
骨的功能是为肌肉收缩提供附着处及保护内脏等重要的生命器官。一般认为骨在细胞水平上是不活跃的，事实上骨的细胞在不停地进行着细胞代谢，不仅骨的细胞之间会相互作用，还存在骨髓中的红细胞生成细胞、基质细胞相互作用，以进行骨的改建和重建。有二种细胞在骨代谢中起着重要的作用，一种是吸收骨基质的破骨细胞，另一种是合成骨基质的成骨细胞。该两者分布在骨膜、骨小梁及骨皮质处。在两种细胞相互作用的部位被称作为基本多细胞单位。在每一个基本多细胞单位，骨可因破骨细胞的吸收而消失，也能被重新合成骨的成骨细胞所取代。有些成骨细胞被掺合在骨基质中变成骨细胞。
在某些情况下骨的细胞可生理性死亡，例如骨骼生长板的钙化。当生长板的软骨钙化，肥大的软骨细胞就会消失，其原因可能是由于软骨细胞凋亡。为达到骨代谢平衡，破骨细胞通常在停止破骨时即消失，亦可能是某种形式的死亡，或通过诱导死亡来调节破骨细胞前体的数量以调节该部位成熟破骨细胞的多少。目前尚难以估计细胞死亡对控制成骨细胞的活动有多大的作用。从理论上预计成熟的成骨细胞的数量受其有丝分裂和细胞前体凋亡的调节。虽然成骨细胞可分化为骨细胞或干细胞，但成骨细胞本身亦可出现细胞死亡。
二、破骨细胞凋亡
破骨细胞的数量很少，在整个骨的表面仅很小部分，故甚难以找到，只是在大约上百万个成人骨改建重塑点能被发现。破骨细胞对骨基质的破坏是极其迅速和有效的，为维持正常的骨骼内平衡，必须严格调控其活动，一旦失去调控即会出现象骨髓瘤等骨质吸收、破坏性疾病的严重后果。
破骨细胞是由血细胞生成前体(haematopoietic precursor)分化而来。血细胞生成前体与单核巨噬细胞前体在分化的晚期才有表现型上的区别，此即血细胞生成前体开始具有成熟破骨细胞(多核、骨吸收)的特点。如抗酸性磷酸酶酒石酸酯(tartrate
resistant acid phosphatase，TRAP)的表达与降钙素受体。血细胞生成前体的增殖与分化亦受多种因子的调节。如：甲状旁腺素(PTH)、1，25-D1、性激素、IL-6、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte
macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage-colony
stimulating factor，M-CSF)等。有人认为，成熟的破骨细胞对大多数刺激或阻止它破骨活动的因子缺乏受体，但对此观点存在分歧，原因是研究所用的破骨细胞中还混杂有其他的细胞和物质。有实验表明，一旦破骨细胞形成并破骨，有两个因素可调节其破骨活动，一是成骨细胞株产生的溶解递质，二是增加或缩短破骨细胞的生命周期。由于大多数有核细胞都会出现细胞凋亡，而生理性刺激可使细胞凋亡开始或终止，故在理论上可认为破骨细胞的活动受可调控的细胞凋亡因素的调节。
(一)破骨细胞的归宿
很早就有人发现，在形态上发生了退变的骨表面缺乏破骨细胞。近年来有人研究在骨重塑的逆转期，破骨细胞发生裂变，在骨表面形成巨噬细胞样细胞。在研究钙缺乏的小鼠补充钙后其骨表面破骨细胞快速丢失的实验中，观察到破骨细胞在特定情况下正在死亡。Fuller等人首次证实了体外破骨细胞凋亡。他们发现离体的小鼠破骨细胞若不用
M-CSF处理就会出现凋亡。体内破骨细胞凋亡是Boyce等人通过转基因鼠株证实的。在这些鼠中，SV40T抗原被TRAP启动因子控制，产生了异常分化的破骨细胞及其前体。一个有趣的现象是破骨细胞数量的增加，并不出现骨质疏松而是出现骨硬化病(骨密度增加)，用DNA末端标记技术发现，其原因是破骨细胞出现了细胞凋亡的形态学特点，提示增加破骨细胞的凋亡可减少骨的吸收。破骨细胞凋亡在破骨细胞生命周期中是一种生理性的活动吗?有人通过在鼠颅骨上局部注射重组IL-1后进行组织学研究来回答这个问题。实验发现IL-I可引起严重的局部骨吸收，但注射停止几天后，骨吸收亦突然停止，并有新骨形成。在最后一次注射后的第4天，组织学发现高达13％的破骨细胞出现细胞凋亡的特征，即失去与骨表面的连结、细胞浆的收缩和空泡、核染色质凝聚、核碎裂。破骨细胞出现此类特点见于吸收骨活跃的部位，通常在破骨和成骨交替出现处。
(二)破骨细胞凋亡的调节
1．研究破骨细胞凋亡的方法研究破骨细胞凋亡比较困难，原因有以下几方面：细胞的数量少，在形态上出现能被识别的凋亡特征的时间短，分离大量的体外细胞很困难，并且分离出的细胞还不纯。尽管如此，根据破骨细胞在凋亡时会持续表达TRAP的特点，可以在组织学切片上识别它，以此建立了活体和体外定量研究破骨细胞凋亡的技术。常用的有DNA链末端标记吖啶橙染色技术(DNA
strand end-labelling and acridime orange staining)。另外用来研究骨吸收和破骨细胞形成的技术可以间接检测破骨细胞的活动情况。如，刚出生的新生鼠颅骨培养24小时可反映破骨细胞的活动，而不必去收集或激活破骨细胞。IL-1和M-CSF也可用于破骨细胞凋亡的研究，其作用是通过抑制细胞凋亡来延长培养的破骨细胞存活期。
2．影响破骨细胞凋亡的几种因素
(1)促钙激素和细胞因子：一般来说，刺激骨吸收的因子阻止破骨细胞凋亡，而抑制骨吸收的因子促进破骨细胞凋亡。但降钙素是个例外，它抑制骨吸收，但不影响破骨细胞凋亡。目前已知在激素和细胞因子中，促进破骨细胞凋亡的有：皮质激素、17β-雌二醇、睾酮、TGFβ；抑制破骨细胞凋亡的有：甲状旁腺素、1，25-D、M-CSF、IL-1、
TNFα、IL-6。
(2)雌激素：在切除卵巢的鼠可观察到17β-雌二醇(E2)在活体和体外都促进破骨细胞凋亡。该实验提示E2促进破骨细胞凋亡可能是其抑制绝经后骨质疏松发展的机制。反之，破骨细胞未显示，至少部分可说明在绝经后出现骨质疏松，与破骨细胞的活动增强有关。虽然目前尚无直接的证据来支持后一种推断，但有资料表明，如TNFα、IL-1、IL-6和M-CSF这些细胞因子在雌激素降低后介导破骨细胞数的增加和骨吸收。在所有抑制破骨细胞凋亡的因素中，最具有说服力的是雌激素能影响破骨细胞形成的实验研究。该实验是用切除了卵巢的鼠的骨髓腔与假装切除卵巢组对比，破骨细胞数明显增多，雌激素处理后破骨细胞数下降。用雌激素处理骨髓细胞培养的另一个实验亦提示，除增加破骨细胞凋亡外，TRAP阳性的单核细胞凋亡亦增多，说明雌激素可能是通过减少破骨细胞前体来抑制破骨细胞的形成。雌激素(E2)尚与雌激素协同剂(cp-336，156)通过细胞凋亡机制抑制破骨细胞形成。
(3)细胞基质：许多类型的细胞一旦与其正常基质相分离，即可因细胞凋亡而死亡，该过程被定义为anoikis。破骨细胞也是如此。在基本多细胞单位的逆转位点，破骨细胞出现细胞凋亡之前与骨表面相分离。用牙质切片培养的破骨细胞比塑胶(plastic)上培养的破骨细胞其细胞凋亡的发生率要低，说明破骨细胞在不同的环境中，与基质发生分离是不一致的，但破骨细胞与基质分离有阻止二磷酸盐化合物(bisphosphonates)诱导破骨细胞凋亡的作用。此外，双磷酸酶特异阻滞肽也有诱导破骨细胞凋亡的作用，其发生机制是因为阻止了基质的连结还是一种直接的受体配体相互作用，目前还不清楚。
(4)药物：二磷酸盐化合物是众所周知的骨吸收抑制剂，可用于Paget病、恶性肿瘤引起的高血钙症及骨质疏松的治疗。作用机制尚不完全清楚，但不论活体或体外研究均证实其能促进破骨细胞的凋亡，因此用以治疗溶骨性疾病不失为一种可行的方法。
(5)转移生长因子：转移生长因子抑制破骨细胞凋亡的详细机制还有待进一步研究。已有的证据表明转移生长因子β(TGFβ)在雌激素促进破骨细胞凋亡中起重要作用，因非特异的TGFβ抗体能使破骨细胞凋亡发生逆转。
三、软骨内成骨细胞的凋亡现象
软骨内成骨是骨形成的主要方式之一，人体的四肢骨、盆骨、脊椎骨等均以此方式形成。软骨内成骨包括软骨细胞的增殖、成熟、肥大和退化以及凋亡等步骤，在时间和空间上受到严格的调节与控制，任何一步骤发生问题均可导致骨发生障碍，形成成骨不全和发育不良等症状。对于软骨内成骨的发生机制已在基因和细胞水平作了大量研究。
(一)骺板软骨细胞的凋亡现象
骺板以典型的软骨内成骨方式不断形成新骨，使骨干得以延长。从骨骺到骨干方向，骺板依次为静止带、增殖带和肥大带，肥大带上1/2为成熟区，下1/2为退化和临床钙化区。过去认为骺板末端软骨细胞的最终命运是死亡，现已认识到这实际上是程序性死亡，即细胞凋亡现象。Roach等在以小鸡股骨骺板为材料的研究中发现，肥大软骨细胞可以直接发生凋亡，亦可以先进行一次不对称的分裂。其中一个子细胞凋亡，另一个则成为成骨细胞，肥大软骨细胞也可以直接分化为成骨细胞。
除肥大软骨细胞外，骺板上处于各个分化阶段的软骨细胞都有凋亡现象发生。
Aizawa等用TUNEL技术检测了不同年龄日本白兔股骨头骺板的细胞凋亡情况，同时检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。结果在静止带、增殖带和肥大带上均发现TUNEL阳性细胞，以肥大带最多。年龄不同，阳性率也不同，在5、10、15和20周龄的兔骺板细胞中阳性率分别为3.1％、7.8％、17.8％和26.6％，呈逐渐增高的趋势。细胞增殖情况与凋亡相反，4个年龄组的PCNA阳性率分别为55.5％、33.3％、22.6％和12.7％，呈递减趋势，表明随着年龄增长。骺板通过凋亡机制亦逐渐趋于关闭。
（二)细胞凋亡与软骨发育不良
软骨发育不良是由于骺板软骨细胞末端分化异常造成的四肢矮短现象，是发生侏儒症的主要原因。Stanecu报道，软骨发育不良患者的骺板软骨细胞发生明显变化，排列紊乱，有较多的坏死。胫骨软骨发育不良常发生于生长旺盛的小鸡，以骺板成熟面形成不能血管化亦不能矿化的损伤为特点，该处细胞大多在向肥大软骨细胞分化的中期即停止发育，由于增殖带细胞仍继续分裂，结果可导致损伤面不断扩大。胫骨软骨损伤处的软骨细胞具有凋亡的形态特征，即胞体皱缩、核缩小、胞浆稀少等，TUNEL原位检测呈阳性，DNA琼脂糖凝胶电泳呈梯带状，用ELISA法进行定量检测显示，胫骨软骨损伤处的软骨细胞所含DNA片段是正常肥大软骨细胞的两倍，而增殖带细胞内无明显的
DNA片段。胫骨软骨细胞的不正常凋亡导致骺板活力下降，软骨内成骨受到抑制。
(三)影响细胞凋亡的因素
甲状旁腺激素相关多肽(PTHrP)是软骨内成骨的重要调节因子。PTHrP缺陷型小鼠(PTHrP-/-)的骺板形态与野生型小鼠(PTHrP+/+)不同，其增殖带很短，软骨细胞肥大和凋亡的速度明显较快，骨骼发育不正常，四肢矮短。若将PTHrP基因置于Ⅱ型胶原基因启动子的控制之下，使其过量表达，此转基因小鼠的骺板软骨细胞则与PTHrP缺陷型相反，肥大与凋亡的进程均受到明显抑制，骨骼发育延迟，形成矮型小鼠。最近，发现一种人类罕见的短肢型侏儒症(Jansen型干骺端软骨发育不良症)，亦表现为骺板软骨细胞凋亡受到抑制。现已证实，该病由PTHrP受体的第223位组氨酸突变成精氨酸而引起，受体被组成型激活，在未与PTHrP结合的情况下也持续发挥信号传导作用，导致与PTHrP过度表达相同的结果。上述现象表明，PTHrP限制软骨细胞的成熟及末端分化，是细胞凋亡的抑制因素。
PTHrP并非直接抑制细胞凋亡，而是通过上调Bcl-2的表达水平来实现，Bcl-2是细胞凋亡的抑制剂，位于PTHrP信号传导途径的下游。Wang等用免疫组化方法检测
Bel-2和促凋亡因子Bax在大鼠胫骨骺板上的表达情况。Bcl-2在增殖带的表达水平很高，成熟区明显下降，退化软骨细胞中的表达量很低。Bax在整个骺板上都有表达，表达量基本不变，表明Bel-2通过拮抗Bax的作用可维持软骨细胞的增殖和分化，至末端分化阶段时Bcl-2的表达减少，由Bax促使肥大软骨细胞凋亡。
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是强有力的血管发生刺激剂，亦是强烈的细胞有丝分裂剂，同时bFGF还是许多静止或末端分化细胞的存活因子，这些细胞以自分泌方式产生bFGF，若以反义RNA抑制内源性bFGF的产生，此类细胞即发生凋亡。
BFGF在骺板增殖带的表达水平最高，成熟区下降，肥大区不表达。bFGF受体的表达与之相对应在一种矮型小鼠的胫骨骺板上，增殖带和成熟区的软骨细胞只有很低的
bFGF表达，小鸡胫骨软骨发育不良型骺板上，胫骨软骨损伤处软骨细胞的bFGF表达水平也很低。由于该区域的细胞凋亡处于过分活跃状态，说明bFGF确实具有抑制细胞凋亡的作用。据报道bFGF也是通过上调Bcl-2的表达来抑制细胞凋亡的。
四、骨、关节生长发育和功能改建中的细胞凋亡及其基因调控
(一)骨、关节生长发育中的细胞凋亡及其基因调控
在胚胎发育过程中，骨与软骨的形成均由未分化的间充质细胞分化而来的，从间充质细胞聚集、增殖、分化、成熟到最后形成骨和关节的整个过程中，以及在生理、病理情况下骨、关节的改建中都有细胞凋亡的参与。Farnum等和Lewinson等认识到生长板软骨内成骨中软骨细胞进入肥厚层后以自发死亡方式终结。Roach等通过鸡股骨软骨生长板的培养发现软骨生长板肥厚层软骨细胞在向骨端移动的过程中逐渐凋亡，证实了软骨内成骨中凋亡是软骨细胞的主要消亡方式。Amling等用免疫组化染色观察到在整软骨生长板都有Bel-2的表达，而且以深层增殖层软骨细胞和浅层肥厚层软骨细胞表达水平为高，深层肥厚层细胞表达水平低。Bax则与Bcl-2相反，在增殖层细胞并无表达，向肥厚层表达逐渐增强，Bcl-2和Bax的此表达特点，可能是导致成熟的肥厚层软骨细胞走向凋亡的主要原因。Bcl-2基因与骨骼生长发育的密切关系亦可从剔除Bcl-2的小鼠所表现出的短耳、短趾的特点中得到证明。Amling等认为剔除Bcl-2基因的小鼠软骨生长板明显变薄，其主要原因是增殖层减少，可能因剔除Bcl-2基因可加速软骨细胞的分化，使软骨细胞成熟加快，导致整个骨骼变短。以上结果表明，Bcl-2在软骨细胞的成熟中发挥着重要的功能。在Amling的实验中尚发现甲状旁腺激素相关肽(PTHrP，在骨髓发育中通过自分泌及旁分泌发挥作用)的表达、分布与Bcl-2一致，显示Bcl-2是
PTHrP下游的发挥抑制软骨细胞分化的基因。
此外，小鼠四肢的发育过程有明显的细胞凋亡现象，凋亡主要发生在趾间及未来关节的形成区，对趾间的分离及关节腔的形成有重要意义。Kimura等对11～15天胚胎小鼠的四肢发育过程进行了连续观察，结果发现胚胎13天时趾间的间充质细胞凋亡区扩大，并从近端向远端逐渐扩展，未来关节形成区的细胞凋亡也从近向远出现，证实了细胞凋亡对于趾间的分离、趾骨与掌骨的分离和关节腔的形成是必需的。Abu-Hijleh等报道，在鸡膝关节等大关节的形成过程中同样有细胞凋亡出现在关节腔形成前，或与其相伴出现。提示细胞凋亡不仅与骨的生长发育有关，而且也可能是关节腔形成的因素之一。
(二)骨、关节生长发育中细胞凋亡的调控信号转导
骨和关节的形成是一个复杂的过程，它包括前期软骨凝聚区的形成、软骨细胞的生长和分化、关节的发育及软骨的骨替代，在这一过程中受到许多生长因子如骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子(TGF)-β等及其他一些信号分子的调控。已有研究表明。BMP及TGF-β是重要的信号分子，不仅可直接诱导细胞分化，而且可能通过诱导或抑制细胞凋亡的作用影响骨和关节的正常发育，甚至导致骨和关节的发育畸形。
Ganan等利用肝素颗粒携带具有生物活性的BMP-4、TGF-β1、TGF-β2入鸡趾胚不同部位后。发现TGF-β植入后可能抑制该部位间充质细胞凋亡，发生额外趾畸形。这一结果的出现是由于TGF-β使BMP-4、MSX-1、MSX-2基因的表达下调，以及ck-erg(是ets基因家族成员，属于转录调节因子)基因的异位表达所致。而BMP-4植入趾间及趾尖部10小时后，植入颗粒周围的间充质细胞就开始出现凋亡，20小时后整个趾间均有凋亡现象，趾尖部间充质细胞凋亡甚至导致出现分裂趾。除BMP-4外，Macias等用同法植入BMP-2和OP-1的表达区相一致，说明细胞凋亡是由BMP-2和OP-1所介导的。尤其引起注意的是，OP-1在处于分化的软骨骨膜上的高表达于临近关节处中断，并且与植入OP-1颗粒后ck-erg基因表达的下调区相一致；与OP-1相反，BMP-2则在关节腔表达，植入BMP-2颗粒可引起细胞凋亡异常，进而导致参与关节的发育形成，尤其BMP-2对于关节腔的形成是至关重要的。BMP和TGF-β作为信号分子可以促进或抑制细胞的增殖，分化与凋亡，参与骨和关节的发育。
(三)骨改建中的细胞凋亡
Noble等于1997年报道，成年人的股骨头和髂嵴虽有少量的凋亡细胞，但凝胶电泳并未出现明显的DNA
ladder，在儿童颅盖骨和成人的异位骨中却有明显的凋亡，电泳可见明显的DNA ladder。细胞凋亡在生长、代谢活跃的骨组织中表现明显，反映出细胞凋亡可能与骨的塑形和功能改建有关。
五、骨折愈合与细胞凋亡
为观察骨折愈合过程中细胞凋亡的作用，Landry等建立了大鼠单纯性骨折及骨折软组织复合损伤模型，结果发现两组动物骨折区都有成骨细胞凋亡，细胞凋亡数目在整个骨折愈合过程中均有变化，凋亡细胞和凋亡小体在成骨细胞分化达到高峰时最多，骨折愈合后，成骨细胞以细胞凋亡的形式被清除。该结果显示细胞凋亡不仅与骨折愈合过程中的成骨细胞的分化有关，而且在骨折愈合的全过程中均有作用。Nakayama等通过观察p53基因阳性和阴性小鼠股骨干的骨折愈合过程，发现骨痂在骨化的区域均有凋亡细胞。证实骨折愈合过程中，成骨细胞及其他一些多余细胞的清除是通过不依赖p53基因的细胞凋亡而实现。
由此可见，在骨和关节的生长发育、炎症损伤中确有细胞凋亡的参与，目前虽然对骨、关节生长发育和功能改建中的细胞凋亡有了一定认识，但其相关基因及其调控机制尚不清楚。进一步研究细胞凋亡及其基因调控和信号传导过程在骨、关节生长发育中的作用，对于探明骨和关节的发育异常及疾病发生的机制，进而探索新的生物和基因治疗方法有着重大的意义。
摘 要
在骨代谢中，吸收骨基质的破骨细胞与合成骨基质的成骨细胞均起重要作用。分离、培养这类细胞虽较困难，但目前已证实在骨进行重建时，均会出现细胞凋亡的形式。对破骨细胞的研究比较深入，涉及其分化、调节和转归等方面。破骨细胞由血细胞生成前体分化而来，其凋亡受促钙激素、细胞因子、雌激素、细胞基质以及二磷酸盐化合物等的调节。促进破骨细胞凋亡或解除阻止破骨细胞凋亡的因素，有利于减少骨吸收，是治疗骨质疏松性疾病的一个重要的研究方向。由于对成骨细胞凋亡的研究，在方法上尚有一定难度，尚有不少尚未肯定的问题。软骨发育不全性侏儒症、骨关节病、甲状旁腺功能亢进、Paget病、绝经后骨质疏松、骨肿瘤等溶骨性破坏等骨代谢性疾病均有骨的细胞凋亡参与。
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