[摘要] 目的 观察救脑益智水提液对半乳糖老化小鼠海马神经元的神经元存活信号转导通路和凋亡级联反应中某些蛋白质表达的影响。方法 昆明种小鼠4组，每组24只，对照组（C组）、模型组（D组）、大剂量中药治疗组(B组)、小剂量中药治疗组（S组）。除C组外、3组小鼠每日皮下注射半乳糖50mg/kg体重。其中B组和D组每日分别灌胃救脑益智胶囊水提取液，相当于生药1g/kg和0.3g/kg。C组和D组分别灌等量生理盐水。共3个月。结果 D组的海马神经元中Akt/PKB 、CREB和Bcl-2的免疫组化阳性细胞数明显减少，而AIF和Bax明显增加，PP-1也明显减少。S组可使这些改变恢复正常、而B组却无此作用。结论 小剂量救脑益智水提液对半乳糖海马神经元的存活信号转导通路和凋亡级联反应的改变具有恢复正常的作用。而大剂量则无此作用。
关键词 救脑益智胶囊、半乳糖老化小鼠、海马神经元、信号转导

[Abstract] Objectives: The objective of this Study is to investigate whether the liquid extract of Jiunaoyizhi capsule has a protective effect on neuronal impairment of the aging mice induced by

基金项目：国家科技部973课题资助项目（编号G2000057005）
作者单位：1.首都医科大学宣武医院，北京脑老化重点实验室 北京100053
　　　　　2.首都医科大学病理系 北京100054
　　　　　*通讯作者
D-galactose. Methods: We applied several antibodies to detect the immunoreactive positive neurons in hippocampus. Results: We have found that in the D-galactose-induced aging mice. The Akt/PKB、CREB and Bcl-2 ir as well as PP-1 positive neurons decreased obviously, but AIF and Bax ir positive neurons increased significantly . The mice treated with 0.3g/kg liquid extract of raw herbs could make these changes normal. Conclusions: The small dosage of jiunaoyizhi has effect on the impairment of signal pathway of hippocampal neurons in aging mice. But the unexpected result is that the 1.0g/kg liquid extract exerts effect on protein expression as mentioned above.
　　Key words Jiunaoyizhi capsule, D-galactose-induced aging mice, hippocampal neurons , signal pathway.

　　救脑益智胶囊在临床上治疗一些脑萎缩等病人，据认为有一定效果（1）。我们将救脑益智方剂的水提液在体外应用SY5Y人神经母细胞瘤细胞系证明该药具有促进神经元胞体增大和突起的延长，可能与促进线粒体功能（MTT试验）有关（张景艳，孟艳，赵志炜等. 救脑益智胶囊对人神经母细胞瘤株SY5Y生长的影响 中国中西医结合杂志 待发表）。本文应用半乳糖老化小鼠观察救脑益智中药对海马神经元的保护作用。

材料和方法

一. 实验动物及动物模型建立
　　昆明小鼠，雄性，体重25～30克，购自中国药品生物制品检定所实验动物中心，随机分为四组：正常对照组（C组）、D-半乳糖对照组（D组）、大剂量药物治疗组（B组）、小剂量药物治疗组（S组）。救脑益智胶囊由山西省曲沃县神经医学研究所、北京东城区朝阳门医院脑萎缩诊室曹子青大夫提供（救脑益智的成份包括黄芪、党参、白术、肉苁蓉、龟甲等二十余味中药。其粉剂用蒸馏水煮沸30分钟，三次，将上清液合并调整至1克/ml生药，用时稀释为1克/10ml）。D-半乳糖购自北京化学试剂公司。小鼠造模D、B、S三组每日皮下注射半乳糖50mg/kg体重，随后在治疗组分别灌胃0.3克/kg体重和1克/kg体重救脑益智水提取液，C组每日给动物注射并灌注等量的生理盐水。连续三个月，成模后C、D、B和S组各24只。
二．动物取材
　　3个月后，处死动物，用水合氯醛4ml/kg体重腹腔注射麻醉，开胸暴露心脏，经左心室插管，同时剪开右心耳，快速灌注生理盐水，待肝脏变白后，改灌4％中性多聚甲醛固定液，至小鼠僵硬。取脑投入30％蔗糖中性多聚甲醛溶液中后固定24～48h，待脑组织下沉后，取中段进行冰冻切片，厚度40μm。
三． 免疫组化染色结果观察及定量分析
　　免疫组化染色采取漂浮染色法，I抗Bcl-2、Bax及SP试剂盒购自中山公司；I抗Akt/PKB(蛋白激酶B)、CREB（cAMp response element binding Protein）、PP-1（蛋白磷酸酯酶-1）、AIF（凋亡诱导因子）由我室通过人工合成多肽、交联KLH后免疫小鼠，产生的多克隆抗体。实验步骤按本室常规进行，阴性对照以正常鼠血清替代I抗（2）。
　　在显微镜下观察海马神经元，并进行免疫反应阳性细胞计数形态学。每组动物于相应海马的部位连续切片，每隔2张取1张，共取18张切片，在10倍物镜下计算海马CA1区的阳性神经元数目。数据处理：采用SPSS 6.0软件包，计数资料用均数±标准差表示，显著性检验采用单因素方差分析法。

结果
一、免疫组化及定量分析：Bcl-2、CREB、Akt、PP-1免疫组化染色，C组及S组深染的阳性细胞在海马广泛分布，细胞计数与D组、B组有显著性差异；高倍镜下在皮层与海马可见胞浆及突起（2～3级）内有棕黄色阳性反应颗粒，胞核不着色，阳性细胞为梭形或星形。D组与B组海马阳性反应细胞着色浅，少有突起，细胞数目少。 D和B组中Bax和AIF的免疫组化染色深染的阳性细胞在海马广泛分布，细胞计数与C组及S组有显著性差异；高倍镜下在皮层与海马可见胞浆及突起，突起分枝达2～3级，胞浆内有棕黄色阳性反应颗粒，胞核不着色，阳性细胞为梭形或星形。C正常组及S治疗组海马阳性反应细胞着色浅，少有突起，细胞数目少。
　　四组小鼠不同抗体免疫组化染色见Bcl-2 (图a1～4)，Bax (图b1～4)，CREB (图c1～4)，Akt/PKB (图d1～4)，PP-1(图e1～4)，AIF(图f1～4)，海马阳性神经元数目 (见表1)。

Bcl-2正常对照组	Bcl-2半乳糖老化模型组	Bcl-2小剂量治疗组	Bcl-2大剂量治疗组
Bax正常对照组	Bax半乳糖老化模型组	Bax小剂量治疗组	Bax大剂量治疗组
CREB正常对照组	CREB半乳糖老化模型组	CREB小剂量治疗组	CREB大剂量治疗组
Akt/PKB正常对照组	Akt/PKB半乳糖老化模型组	Akt/PKB小剂量治疗组	Akt/PKB大剂量治疗组
PP-1正常对照组	PP-1半乳糖老化模型组	PP-1小剂量治疗组	PP-1大剂量治疗组
AIF正常对照组	AIF半乳糖老化模型组	AIF小剂量治疗组	AIF-1大剂量治疗组

表1 四组小鼠脑海马神经元
免疫反应阳性细胞数比较

二、蛋白质相互间比值的变化：5种蛋白质可分为二组，一组具有抗凋亡作用（Akt/PKB、Bcl-2、CREB）；一组具有促进凋亡的作用（Bax、AIF）。表达这些蛋白质的阳性细胞数比值表明促进细胞凋亡的AIF和Bax二者的比值在各组无明显改变，平均为1.01（范围0.83-1.11）。而有利于神经元存活的蛋白与促进凋亡的蛋白质比较，半乳糖老化小鼠的4种比值下降51%-47%，而小剂量中药治疗组比值比对照组下降仅3%-19%。说明小剂量组能明显提高它的比值促进神经元存活（见表2 ）。

表2：5种蛋白质相互间比值的变化

讨论
　　救脑益智胶囊在体外实验证明对SY5Y人神经母细胞瘤系细胞具有神经营养作用，但其营养作用的机理不明。我们以前研究表明半乳糖老化小鼠全脑神经元出现大量Tunel阳性细胞，C-Jun、C-fos、Fas和Fasl表达明显增加，说明神经元呈现凋亡和凋亡前状态（Pro-apoptosis）(未发表资料)。为进一步证实我们的设想，本文研究了半乳糖老化小鼠海马神经元的神经元存活信号转导途径和与凋亡相关的五种蛋白质的免疫反应阳性细胞数。结果表明半乳糖小鼠具有抗凋亡作用的Akt/PKB、Bcl-2和CREB表达明显下降，而与凋亡密切相关的蛋白质AIF、Bax则明显增加，表明半乳糖老化小鼠确实存在神经元存活信号转导通路的障碍和启动了神经元凋亡的级联反应。在正常情况下，神经元依赖神经营养因子激活神经元存活信号转导通路控制凋亡级联反应（图1）（3、4）。其中最重要的维持细胞存活的成份是Akt/PKB和CREB。Akt/PKB使Bad磷酸化（Bad与Bax属于同一诱发凋亡的成员），继而使CREB磷酸化，使抗凋亡蛋白Bcl-2增加，细胞存活。Bcl-2和Bad是控制线粒体通透小孔（PTP）的主要成份，Bcl-2/Bax比例下降，导致线粒体腔内诱发凋亡的一些因子释放，最终可导致凋亡。表2说明半乳糖老化小鼠的线粒体功能受损。Bcl-2/Bax和Bcl-2/AIF比值明显下降，AIF表达增加并溢至胞浆引起凋亡级联反应。半乳糖老化小鼠、PP-1免疫反应阳性细胞数明显减少。PP-1与突触可塑性和记忆形成有关，控制突触蛋白磷酸化和去磷酸化与调节突触强度的长时间维持（long-term maintenance）有关。在海马CA1区和齿状回、PP-1可激活突触中介的长时间增效（LTP-Long-Term Potentiation）。因此半乳糖老化小鼠PP-1在海马神经元表达明显减少、提示海马组织内突触传递受到影响，可能使老化小鼠学习记忆功能减退（5、6）。本研究应用中药救脑益智的水提取液、小剂量能使六种蛋白表达恢复正常，提示救脑益智胶囊中含有神经元存活因子样成份，但是大剂量却无此作用，目前对此结果难以解释，但与体外研究结果一致（未发表资料）。推测在水提取液中含有少量神经元存活信号转导通路的抑制物，当抑制物增加到一定浓度后能抑制水提取液中的启动信号转导的神经元存活因子的作用，但这一推测需进一步证实。

图1：神经元信号转导通路对凋亡的控制


参考文献
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