内容提要 目的：通过观察救脑益智胶囊对人神经母细胞瘤株SY5Y信号转导的影响，探讨此药促进神经细胞生长的可能机理。方法：以人神经母细胞瘤株SY5Y为细胞模型，分为正常对照组和加药组。收集对照组及实验组细胞裂解物，取上清用Lowry法进行蛋白定量，将总蛋白量相等的样品进行免疫沉淀Western blot分析。结果：与正常对照组比较，加药组SY5Y细胞Akt/PKB, CREB、P-CREB表达增加，细胞色素C表达减少。 结论 救脑益智胶囊的生药水提取液能促进SY5Y神经母细胞存活信号通路中Akt/PKB，P-CREB的表达，推测其促进体外培养的SY5Y神经母细胞生长的机理与其促进神经元信号通路中有关蛋白质的表达有关。
关键词 救脑益智胶囊 、人神经母细胞瘤株 、信号转导
　　救脑益智胶囊在临床上治疗一些脑萎缩等患者，有一定效果（1），已有实验证实该药水提取液在体外具有神经营养作用，促进神经细胞生长，但其作用机理尚
未明了。本文旨在通过研究救脑益智胶囊对SY5Y细胞信号转导通路有关蛋白质表达的影响，探讨此药促进神经细胞生长的可能机理。

材料和方法
1. 细胞模型
人类野生型神经母细胞瘤细胞株(HY-SY5Y)
2. 药物 救脑益智胶囊由山西省曲沃县神经医学研究所、北京东城区朝阳门医院脑缩科曹子青大夫提供。救脑益智胶囊成份包括黄芪、党参、白术、肉苁蓉、龟甲等二十余味中药，其粉剂用蒸馏水煮沸30min，两次，将上清液合并调整至1g/ml生药。
3. 主要试剂及抗体
1).主要试剂：
　　Protein G-Sephorose，Boehringer Mannheim公司产品。高分子量标准蛋白，Gibcol公司产品。碱性磷酸酶显色试剂盒，Santa Cruz生物技术公司产品。
2).抗体：
　　cAMP 应答元件结合蛋白（CREB）、Akt/PKB、细胞色素C()抗体为本室自行制备，采用固相合成法合成相关蛋白片段（CREB，RPSYRKILND；Akt/PKB:RPHFPQFSYSASGTA； ），然后分别与血蓝蛋白交联后免疫小鼠，ELISA检测抗体效价最高在1：10000到1：100000之间。
　　P-CREB(磷酸化的CREB)抗体为Santa Cruz生物技术公司产品。
4 方法
1）.SY5Y细胞培养
　　细胞培养条件为MEM(Gibco BRL,41500-067)，培养基中加入体积分数为10％的灭活胎牛血清(Hyclone，SH30071.03)、(DNN company)、青霉素、链霉素 ，，，每周换液两次，传代一次。
2）.免疫沉淀Western Blot分析法
　　将SY5Y细胞以密度为每毫升个接种于96孔板(Nunc产品)，每孔体积200μl，72h后分为对照组、加药组，每组8-12孔。实验组加50mmol/L的APP17肽，对照组用PBS代替。37℃，培养8-10个小时，收集对照组及实验组细胞裂解物（冰浴中操作），离心，取上清，将总蛋白量相同的对照组和实验组上清分别加入Sepharose-protein G 25ml及抗体CREB 5ml、p-CREB 5ml 、Akt5ml 、cytC室温混合4h。反复洗涤上述沉淀物，吸净上清，煮沸变性5min，取上清进行Western Blot分析[4]。第一抗体CREB (1:1000)、p-CREB(1:1000)、cytC(1:3000) Akt/PKB(1:1000)稀释于PBS中室温放置1h，辣根过氧化酶或碱性磷酸酶偶联抗鼠或抗羊IgG中放置1h，漂洗后用碱性磷酸酶显色试剂盒显色。

结 果
SY5Y细胞信号转导相关蛋白表达的改变

讨 论
　　PI3k-Akt/PKB-BAD-CREB-PCREB途径是神经元存活的主要途径之一，在中枢神经系统中，NGF等神经营养因子与受体结合后，启动PI3K信号转导通路，从而使神经元存活。本研究结果表明救脑益智胶囊的生药水提取液能促进SY5Y神经母细胞存活信号通路中Akt/PKB，P-CREB的表达，Akt/PKB，CREB是PI3K通路中的重要成份，Akt/PKB表达的增加一方面促进BAD磷酸化，另一方面也使CREB磷酸化增加，这与我们的实验结果P-CREB表达增加是相吻合的。P-CREB表达增加将促进细胞的存活。另外本药还能促进细胞色素C表达减少。细胞色素C是存在于线粒膜间的凋亡因子，细胞色素C的释放增加将促进细胞凋亡的发生。本室以往的实验证明本药水提取液能促进神经母细胞胞体体积的增加和突起的延长，并能促进MTT代谢，因此，推测提取液促进体外培养的SY5Y神经母细胞生长的机理可能与其促进神经元信号通路中有关蛋白质的表达有关。
参考文献
1．曹子清，侯景伦，张北北. 救脑益智胶囊的药理研究.中医药杂志1995;17:33-36.
2．王蓉，张景艳，艾厚喜,等. APP17肽对谷氨酸引起神经毒作用的影响.中国药理学通报2000;16:313-317.
3．王蓉，张景艳，姬志娟,等. APP N端片段的神经营养作用. 细胞生物学杂志2001;23:103-107.