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| 细胞凋亡与神经系统及其疾病 |
凋亡是一种细胞主动性死亡模式。过去数年，对凋亡的研究，凋亡的基因调控及其机制的研究越来越多。原因：①凋亡不仅见于生长发育阶段，也见于一些病理状态如脑卒中，β-淀粉样肽中毒；②调控凋亡的某些基因如Bcl-2、p35、p53等亦参与调控过程；③基因调控下发生凋亡的机制可能与神经元退行性变有关，有助于研制治疗神经变性疾病的药物；④凋亡在神经元死亡中的主动作用，以及与此有关的调控基因的发现，提示通过治疗阻止凋亡的发生是可能的。
1951年，Glucksmann即已指出细胞死亡的不同类型的形态学差异。在1964年Locksin等提出了程序性死亡的概念，1966年发现在程序性细胞死亡过程中有某些特殊蛋白的合成，提示程序性死亡为主动过程。1972年，Kerr等肝细胞缺血时发现两种完全不同的细胞死亡：①胞膜溶解，细胞器破坏，溶酶体释放，即坏死。②胞膜完整、皱折、染色质聚集、核裂解、胞体以出芽方式被分割成多个小体(凋亡小体)，细胞器保持完整溶酶体膜未破裂即凋亡，并进一步证实凋亡可发生于生理和病理状态，如四肢的生长发育，蝌蚪脱尾变成青蛙，内分泌细胞凋亡，如地塞米松可引起胸腺萎缩，性腺撤退引起前列腺细胞减少。正常细胞的分化过程。如肠绒毛细胞、淋巴干细胞亦与凋亡有关。如抑制淋巴干细胞的凋亡，可发生B细胞淋巴瘤。另一类细胞凋亡可见于病毒感染后的宿主细胞，人类免疫缺陷病毒(HIV)引起免疫缺陷状态多系CD4细胞凋亡，核杆状病毒感染昆虫细胞以后，如感染细胞不表达p53抑制凋亡基因，细胞将于数小时内死亡，但如细胞在病毒感染早期即成功地表达p53，细胞可存活数日。免疫反应的发生亦需要凋亡的参与：如在抗体亲和力成熟过程中，早期相对低亲和力的抗体被高亲和力抗体取代，包括大量增殖的B细胞在抗体亲和性方面的不同的选择，如亲和力低或在缺乏激活的辅助性T细胞条件下增殖，B细胞即会凋亡。
事实上，任何低于引起坏死损伤阈值的损伤因素均可导致凋亡。如细胞在43℃左右培养产生凋亡而45℃则发生坏死(1小时后)，低浓度的过氧化物常引起凋亡而高浓度则引起坏死。此类反应不仅取决于损伤因素本身，且与细胞以及此类细胞不同增殖阶段有关。如未成熟的后根感觉神经节细胞在缺乏神经生长因子(NGF)时发生凋亡，而成熟的后根感觉神经细胞在缺乏NGF时，则不会发生凋亡。
一、凋亡定义
凋亡的定义是形态学上的，形态学标准始终保持一致性，而凋亡的基因或生化标记在不同细胞类型是不同的。早期，染色质浓聚为异染色质并发生周边浓聚。胞膜内隔成有突起，其间含/或不含有核酸片段，并以出芽方式变为所谓“凋亡小体”脱离细胞。胞膜内隔与一种细胞骨架蛋白有关。胞膜以及细胞膜性结构保持完整，凋亡小体最终被邻近正常细胞或吞噬细胞识别和吞噬。电镜下，凋亡细胞被吞噬后可见到膜破坏。如没有细胞吞噬(如培养的细胞)，凋亡将继发坏死而胞膜失去完整性。
在生化水平，核的裂解是在核小体之间进行的，染色体由无数串珠状的核小体组成,其中心为组蛋白八聚体，外面DNA链缠绕。发生在核小体之间裂解使得裂解后的链为单个核小体结构的数倍，每个核小体大约为180bp。然而此种裂解方式是否为凋亡的原因尚有争论。锌(Zn)或ATA抑制核酸内切酶活性可抑制凋亡有助于说明此观点，但此种抑制对引起凋亡的内切酶并无特异性。有些细胞无核小体间的裂解亦可发生凋亡，是因为DNA可在更多位点裂解，其片段在100～300bp之间，机制尚不清楚。
在基因表达水平，细胞凋亡表现为一系列变化：首先，硫化糖蛋白(SGP-2)表达增加。雄激素撤退发生前列腺细胞凋亡时，SGP-2的mRNA表达明显增加近1000倍。阿尔茨海默病(AD)大脑中SGP-2功能尚不明，但SGP-2的抑凋亡活性提示SGP-2有保护作用而不是促进细胞凋亡。另一个在凋亡表达时增加的是组织谷酰胺转移酶，该基因产物参与ε-氨基酸群中的赖氨酸残基的交链作用，此交链作用是阻止细胞内容物外溢的机制之一。从而使凋亡细胞被吞噬前不发生炎性反应。近期研究表明，该酶介导凋亡，其基因产物参与了凋亡过程而不是一种反应产物。第三个表达增加的基因c-los基因。在部分凋亡过程的晚期，c-fos基因转录被激活，但早期作用不清楚。其他在凋亡过程表达增强的基因有RP2和RP8，但其编码的蛋白功能不清楚。
Eugene的实验研究发现，上颈髓神经细胞在撤除神经生长因子NGF，发生凋亡的过程中，有60个以上的信息表达。包括转录因子c-jun，cyclin
D，提示有丝分裂的特征在凋亡细胞中亦可见到，但其他细胞周期基因的表达在凋亡时并不增加。因此虽然有丝分裂与凋亡相互关系已引起人们很大兴趣，但目前仍知之甚少。
二、细胞凋亡与阿尔茨海默病
阿尔茨海默病(Alzheimer’s AD)是一种神经退行性疾病，大脑的神经元丢失是最基本的病理改变。近年研究表明，老年斑的核心组成β淀粉样蛋白(amyloid
protein β- Aβ)，其水平与AD严重程度明显相关，而Aβ的毒性作用的基本特征是神经元凋亡。因而细胞凋亡是AD发病的重要的病理学机制。前体蛋白基因(APP)位于2l号染色体，遗传性的家族型AD患者的Aβ区域附近有7个点突变及其过度表达与AD有关。但是APP的突变仅占AD中的很少一部分，而大部分AD与14号染色体上的PS-1及1号染色体上早老素(presenilinⅡ，PS-2)基因突变相关。
研究亦表明，免疫炎症机制在AD的发生发展中起重要作用。McGeer及Rodgers首先提出AD的神经慢性退行性变可能是脑内免疫与炎症反应不适当激活的结果，超强的免疫反应可“方向错误”性地攻击神经组织，致使细胞损伤及死亡。目前认为，细胞死亡可分两大类，一类是由各种突发的、意外的事件所致的细胞死亡，即病理性细胞死亡。形态学上表现为细胞坏死；另一类为生理性细胞死亡，形态学上表现细胞凋亡。一般而言，细胞凋亡过多，会引起退行性变或早衰。AD患者的海马神经元之中有TRPM-2RNA表达。是神经细胞凋亡的一种表现。近期实验研究提示：细胞凋亡为衰老及AD等神经退行性疾病神经元丧失的原因之一，内外因素激活细胞自身基因程序而引起神经元凋亡。
(一)神经元凋亡的慢性炎症学说
免疫组化研究表明，许多神经疾病尤其AD患者脑内有强烈的局灶性炎症反应，组织培养及分子生物学方法证明脑细胞可产生许多炎性细胞因子(如IL-1β、IL-6、TNF-α、TaF-β等)、补体蛋白及其他免疫分子。炎性蛋白质及小胶质细胞(microglia，Mi)活化同AD病变间的密切关系，为此提出了神经元退化的炎症学说。有关β-淀粉样蛋白(amyloid
proteinβ，Aβ)激活免疫炎症过程而间接造成神经退行性变的假说。已获得不少新的证据。AD患者脑内的Aβ类不溶性大分子以及胞外的NFTs，极易被吞噬细胞发现。因而作为慢性刺激物质而逐渐积累，并刺激炎症反应不断加强，造成AD的慢性炎症状况。
AD的许多促发因素如遗传、年龄、环境因素等均可诱发初始病变(如AD的SP及NFT)，此类病变即使引起某些神经元死亡，亦较轻微，因而病变进展缓慢；然而这些初始病变可激发炎症反应，后者发展至一定程度导致更多的病变，进而激发更严重的炎症反应，如形成一个不断加强的自身毒性环路(autotoxic
loop)。该正反馈环路导致临床所观察到的AD及其类似疾病在起始阶段进展较缓，到某个时期病情才急剧恶化。由此可见，慢性炎症可能是AD发病机制的必要因素。AD是一种由Aβ沉积，通过激活周围Mi产生细胞因子和神经系统免疫炎症应答，加速神经细胞死亡，而致记忆减退及认知障碍的疾病。而记忆与颞叶海马CAl区神经元活性有关，提示AD发病机制之一可能是Aβ启动CAl区神经元细胞凋亡。
(二)神经元凋亡的诱导
细胞凋亡是由细胞基因控制的一种主动死亡过程，特定基因由于种种原因编码自杀性蛋白而致DNA裂解。愈来愈多的证据表明，大多数动物细胞均能自我致死，且此种普遍性的自杀程序能由发自其他细胞的信号所激活或抑制。例如许多发育中的脊椎动物神经元的生存依赖于与其连接的靶细胞分泌的神经营养因子(NTF)，若NTF缺乏可致神经元发生细胞凋亡。细胞凋亡亦受外源性因素影响，但诱导细胞凋亡的内源性与外源性因素都必须通过特定基因而发挥作用。
1．淀粉样蛋白与神经毒
研究表明，Aβ是各种原因诱发AD的共同通路，是AD形成和发展的关键因素。分子克隆研究证明，Aβ来自一分子量更大的β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid
precursor protein。APP)。多数学者认为Aβ在大脑皮层内的蓄积是AD病理发生过程中的一个早期必然事件，超前于其他脑区损伤和临床症状数年。在发生顺序上，Aβ的出现早于神经纤维缠结、轴索缺乏营养等病理变化以及临床症状。最为直接的证据是Aβ在一定条件下能表现出神经毒性。90年代初，Yankner等首先观察到较高浓度的β能引起神经元退化和死亡，并证实引起毒性的必需结构是其25～35位的氨基酸序列(Aβ25～35)。最近发现。Aβ的神经毒性包括两个方面，一是增强或放大各种伤害性刺激如低糖、兴奋毒素、自由基等的细胞损伤效应，一是直接的细胞毒性。实验发现，多数细胞与Aβ接触后就能表现出细胞肿胀、染色质浓缩、核内DNA断裂等细胞凋亡典型的形态和生化特征，仅在少数细胞内或与兴奋毒素共存时才表现出神经元肿胀、膜溶解、乳酸脱氢酶释放等坏死的特征。Aβ的神经毒性涉及到复杂的分子机制，包括促进自由基的形成、破坏细胞内的Ca2+稳态，降低K+通道的功能，增强致炎细胞因子(cytokine)引起的炎症反应。由于多种因素相互影响给研究带来一定的难度。
2．炎性细胞因子和神经毒
(1)白细胞介素6(IL-6)：在中枢神经系统，IL-6主要由Mi与星形胶质产生，其受体也广泛存在于丘脑、海马、皮层等脑区的神经元膜上。IL-6的神经元毒性作用主要在转基因小鼠脑内得到证实。Campbell报道，IL-6转基因小鼠具有严重的神经病症状，表现为瘦小、行为异常、震颤、共济失调和癫痫。神经病理特征为，海马与小脑出现明显的神经元退化，尤其是海马CAl区域树突萎缩，树突空泡化和树突数目减少。且伴随着高表达的IL-6
mRNA和高水平的IL-6。结果表明，脑内IL-6水平的升高是导致转基因小鼠神经元退化的主要原因。IL-6转基因小鼠研究亦发现，隔一海马胆碱能通路的功能受到严重损害，由于隔一海马通路参与记忆印迹的形成，因此脑内高水平的
IL-6可能影响学习与记忆功能。
有关IL-6与Aβ或APP关系的研究已有报道。在原代培养的大鼠皮层神经元实验中，IL-6 200ng/ml与神经元接触6小时之后，APP
mRNA的表达增加了大约一倍。由于IL-6与APP或Aβ共存于AD的SP内，提示IL-6对APP的表达具有直接调控作用，可以促进APP产生，进而导致Aβ沉积，诱发AD。α2-M是已知最强的蛋白酶抑制剂，与IL-6共存于AD皮层与海马SP内。曾有报道，在培养的人神经元细胞株内，α2-M可抑制APP的正常分泌，导致Aβ形成增加。在人SH-SY5Y神经元细胞培养实验中，α2-M的基础合成很低，但用IL-6刺激后其合成被强烈诱导，α2-M水平大约增加了20倍。这些结果提示，IL-6与α2-M在AD脑内的共存具有功能性联系，IL-6可能通过诱导α2-M合成，进而抑制APP的正常酶解。导致Aβ生成与沉积异常增加，从而诱发
AD病理发生。
(2)肿瘤坏死因子-α(TNF-α)：LPS可刺激Mi产生TNF-α，也可能产生少量 TNF-α。在人胚胎原代神经元培养中发现，TNF-α有增强N-甲基-D-门冬氨酸(NM-
DA)受体介导的神经毒性作用，且对人神经元细胞HN33.1有细胞毒作用。大鼠神经细胞培养中，TNF-α通过作用于Aβ间接发挥了细胞毒性而引起神经元的损伤。直接将
TNF-α注射到小鼠小脑，可引起普遍性损伤。TNF-α可引起牛及啮齿类动物的Mi通过 PCD机制发挥细胞毒作用。但这一作用在人类尚未被发现。
(3)转化生长因子-β(TGF-β)：TGF-β是具有多功能作用的细胞因子，可由多种细胞产生，在胚胎发生期的神经细胞发育过程及免疫炎症反应过程中，TGF-β都具有重要作用。大鼠新皮层神经细胞培养中，TGF-β可减少由细胞毒物、缺氧、缺血或谷氨酸引起的细胞损伤，而起到了神经保护作用。使用人类胚胎皮层细胞培养，发现TGF-β可减轻由Aβ引起的神经细胞损伤。TGF-β对神经细胞的这些保护机制目前并不清楚。相反的结果发现，TGF-β可能具有细胞损伤作用。由于其抑制星形细胞谷氨酰胺合成酶的活性而增加外源性谷氨酸造成的神经细胞损伤。亦有报道TGF-β伴随Fos-Iacz的表达而参与细胞凋亡过程。
3．一氧化氮(NO)与神经毒
在人的中枢神经系统，As是产生NO的主要细胞。 IL-1β是一个关键性因子，可直接刺激人As产生NO。TNF-α及IFN-γ可加强IL-β的作用。实验也证明这些白细胞介素处理过的As能产生足够量的NO，而造成神经细胞损伤。Mi产生的NO具有细胞毒性作用，它可能参与神经损伤及神经退行性疾病的病理过程。NO合成酶抑制剂或能抑制Mi活性的物质均可减轻Mi介导的神经元损伤。此外，能释放NO的硝普钠(sodium
nitroprusside，SNP)能直接杀伤培养中的人类胚胎皮层神经元。炎症条件下。脑内的胶质细胞可以表达诱生型一氧化氮合成酶(inducible
NOS，Inos)，产生大量NO。导致神经元坏死或凋亡。一般情况下，持续与低水平的 NO或过氧亚硝酸盐接触引起神经元凋亡，而短暂与高水平的NO或过氧亚硝酸盐接触则引起神经元坏死。
研究结果也证实，前列腺素E2(PGE2)直接与海马神经元接触导致神经元凋亡性死亡。一些神经递质如多巴胺(DA)，谷氨酸盐(glutamate，Glu)等可使某些神经元细胞凋亡。Glu是Mi激活后产生的一类神经毒物质，它是一种兴奋性氨基酸(EAA)。目前认为，神经细胞的缺血缺氧、退行性病变、变性、炎性损伤等都可能与EAA的神经毒性有关。Yamada和Hatanaka报道，在20天胎大鼠海马神经元培养中，Glu与神经元接触15分钟，可引起海马神经元显著退化。
(三)神经元凋亡的基因调控
细胞凋亡受遗传基因调控，在调控细胞凋亡的过程中常有新基因表达，合成新的蛋白。在调控的信号中有的是起正调节作用，有的是起负调节作用。不同的细胞由不同的基因诱导其凋亡。如：ced-3/ced-4、nedd2、TRPM-2、Fas(Apo-1)、c-fos、c-jun、c-
myc、野生型p53等。抑制基因有：ced-9、Bel-2、突变型p53等。此外，IL-1β转化酶家族是一些新发现的细胞“死亡蛋白”，与ced3、nedd2具有高度同源性，在炎症因子诱导的神经元细胞凋亡中起重要作用。
IL-1β转化酶(IL-1 beta-converting enzyme，ICE)是存在于许多哺乳动物细胞内的一种蛋白酶，是近年来研究较多的“死亡蛋白”之一。人类ICE最初是在单核细胞中发现的一种半胱氨酸蛋白酶，可使非活性的前体IL-1p(相对分子质量为33
000)在116位天冬氨酸和117位丙氨酸之间酶解为具有活性的相对分子质量为17 000的IL-1p细胞因子。ICE与线虫细胞死亡基因ced-3有高度同源性。Kumar等先克隆出鼠nedd-2基因，长3.7
kb，其基因编码的蛋白可促进鼠细胞的凋亡，Lin Wang以nedd-2为模板通过PCR扩增制备探针从人胎脑cDNA文库筛选出人nedd-2基因，其编码的氨基酸序列如ICE/ced-3顺序同源。转染小鼠ICE基因或ted-3基因，使其过度表达均可引起小鼠纤维母细胞出现凋亡。此外，在发生凋亡的细胞中可见成熟的IL-1p分泌增多。该结果提示，ICE/ced-3基因可能是决定细胞死亡基因之一。目前认为ICE在由Fas、TNF及一些炎症因子等诱导的细胞凋亡中起重要作用。ICE是Fas、TNF及炎症因子介导的主要通路，其研究的重要性可想而知。AD患者神经细胞退行性改变有ICE参与。由于细胞死亡基因ced-3与nedd-2和ICE为同种物质，是引起细胞凋亡的重要酶，多种因素均可激活该基因，ICE产生可在细胞内产生一种细胞死亡蛋白，而ced-3、nedd-2和
ICE为同种物质，是引起细胞凋亡的重要酶，多种因素可激活该基因，ICE产生的IL-1β对神经细胞起直接或间接毒性作用，导致神经元凋亡。证明ICE表达促进神经细胞凋亡，而对ICE表达的调节。寻找一些抑制ICE活性的药物，对一些凋亡过多的疾病如AD及Parkinson病有重要的治疗潜力。
(四)抗炎药物抑制神经元凋亡的可能性
20世纪的神经科学已获飞速发展，但造成神经元死亡的原因尚未明了，以致许多全球性致死性神经疾病一直缺乏有效的防治手段。AD发病的炎症学说启发人们用抗炎药物减缓或阻止AD发病。它不同于近10多年惯用的两种治疗方法，即基于胆碱学说的各种AchE抑制剂如他克林(tacrine)、新斯的明等和以吡烷酮醋胺为代表的促智药(nootropic
drugs)，被用来试图改善大脑皮层的代谢能力，进而减轻痴呆程度。上述治疗方法并不能减缓皮层神经元的急剧损毁，因而未能消除病变的根本原因。人们转而思索用抗炎疗法来抑制神经元死亡。该设想已被临床试验所证实，有人用非皮质激素类抗炎药物(NSAID)吲哚美辛(indomethacin，IM)治疗AD的一项有安慰剂对照的双盲试验中发现，接受100～150mg/kglM治疗的患者。其认知功能的改善明显优于安慰剂对照组，然而尚需要更大规模的临床试验及进一步研究，以筛选出选择性调节免疫炎症反应与抑制神经元死亡的新药。
三、细胞凋亡与神经变性疾病
中枢神经系统(CNS)不同部位特殊类型神经元的逐渐丧失是各种神经退变性疾病的病理特点。在发育期间CNS是一个强烈的凋亡部位(估计50％～80％的CNS神经元在发育期间死亡)。在成年时其存活似乎有赖于BeI-XL这样的促生存基因的表达。CNS可能特别容易受凋亡途径紊乱的损害，特别是涉及钙和自由基生成的途径。凋亡细胞的死亡及其辅助分子介质可能在许多神经退变性疾病均有作用，例如早老性痴呆、帕金森病、脊柱肌肉萎缩和肌萎缩性侧索硬化。
近年发现早老素2(presenilin 2)基因的突变与家族性早老性痴呆有关。推测pre． senilin
2在凋亡途径中起Fas下游的作用。Presenilin 2的鼠同系物可防止T淋巴细胞上的FasL上调，正常情况下此各现象发生于T细胞与家族性异体肽结合被激活时。在
PCI2神经元细胞系中，正常的presenilin 2的过度表达导致凋亡；从家族性早老性痴呆的主要特征之一是在脑中形成淀粉样蛋白β斑，此外，神经元凋亡的阈值亦发生改变。在原代培养的人类神经元，淀粉样蛋白β的肽碎片能下调抗凋亡的Bcl-2的表达，并上调凋亡的Bax的表达，从而使神经元更易死亡，尤其是在氧化应激反应时。
帕金森病以纹状体多巴胺能的神经元变性为特点，考虑系在对氧化损伤的反应中，通过凋亡和坏死死亡。虽然造成帕金森病的基因较造成早老性痴呆的基因更难捉摸，但帕金森病的治疗证明其发生与抑制凋亡密切相关。在历史上，盐酸selegiline药物曾用于治疗帕金森病，因其能不可逆转地抑制单胺氧化酶B，因此可增强多巴胺的信号。近年发现，selegiline能特异地改变细胞死亡和生存基因的转录，包括过氧化物歧化酶、
Bcl-2和BeI-XL、一氧化氮合成酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶。与此相反，selegi-1ine对单胺氧化酶B的作用可能是次要的。Selegiline可防止线粒体膜电位的进行性还原，因而可抑制线粒体释放促凋亡物质。
四、神经细胞凋亡在神经系统中的作用
细胞凋亡是调节机体生长、发育及维持 | | | |
